人血管内皮细胞生长因子（VEGF） 酶联免疫吸附测定试剂盒

本试剂盒用于体外检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人血管内皮细胞生长因子 （VEGF）的含量。 实验原理： 试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人血管内皮细胞生长因子 （VEGF）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并*洗涤。 用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅 和样品中的人血管内皮细胞生长因子（VEGF）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值）， 计算样品浓度。 样本处理及要求： 1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上 清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 2. 血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分 钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测 量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织 样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂） 加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻 融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。 4. 细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或 -80℃保存，但应避免反复冻融。 注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 需要而未提供的试剂和器材： 1. 酶标仪（450nm） 2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL 3. 37℃恒温箱 4. 蒸馏水或去离子水2021 版 本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断 3 试剂盒组成： 名称 96 孔配置 48 孔配置 备注 微孔酶标板 12 孔×8 条 12 孔×4 条 无 标准品 0.3mL*6 管 0.3mL*6 管 无 样本稀释液 6mL 3mL 无 检测抗体-HRP 10mL 5mL 无 20×洗涤缓冲液 25mL 15mL 按说明书进行稀释 底物 A 6mL 3mL 无 底物 B 6mL 3mL 无 终止液 6mL 3mL 无 封板膜 2 张 2 张 无 说明书 1 份 1 份 无 自封袋 1 个 1 个 无 备注： 1. 标准品浓度依次为：2000、1000、500、250、125、62.5 pg/ml 2. 经过大量正常标本检验，标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内，实验过程中 直接取50μL样本上样即可。当有部分样本值超过最大标准品浓度时，可用样本稀释液将标本 进行适当稀释后再进行实验。 注意事项： 1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温 20-25℃。 使用后立即冷藏保存试剂。 2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干 燥掉。 3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响 OD 值。 4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。 5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。 6. 在储存和温育时避免强光直接照射。 7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。 8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应 试剂的生物活性。 9. 不能使用过期产品。 10. 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。 试剂准备：2021 版 本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断 4 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。 20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。 操作步骤： 1. 从室温平衡 20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回 4℃。 2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL； 3. 样本孔中加入待测样本 50μL；空白孔不加。 4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体 100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育 60min。 5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置 1min，甩去洗涤液，吸水 纸上拍干，如此重复洗板 5 次（也可用洗板机洗板）。 6. 每孔加入底物 A、B 各 50μL，37℃避光孵育 15min。 7. 每孔加入终止液 50μL，15min 内，在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值。 实验结果： 以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标 准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。 （此图仅供参考） 试剂盒性能： 1. 检测范围：62.5 pg/ml – 2000 pg/ml。 2. 灵敏度：检测浓度小于 10 pg/ml。 3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。 4. 重复性：板内变异系数小于 10% ，板间变异系数小于 15% 。